检测原理 —生物膜干涉技术(Bio-LayerInterferometry,BLI)
生物膜干涉技术采用探针式生物传感器对样品直接进行检测,对检测样品无需做任何荧光或同位素标记。通过仪器发射白光到传感器表面并收集反射光,不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响并形成干涉。因此,结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减,光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移,而这种位移可直接反映出传感器表面生物膜的厚度及密度变化,从而对待测分子间的相互作用过程进行精确的定量测定。
4、微量热泳动(MST)系统
提供MonolithNT.115微泳动量热生物分子相互作用检测服务项目。微量热泳动(MicroScaleThermophoresis,MST)是一种定量分析生物分子间相互作用的前沿技术,通过精确检测荧光变化,结合灵敏的热泳动现象,MST提供了一种灵活、强大和快速测量分子间相互作用的方法。MST测试时,由红外激光建立微观温度梯度场,通过荧光染料标记、荧光融合蛋白、色氨酸自发荧光等信号追踪,分子在微观温度梯度场中的定向移动就可以被探测和量化。MST在缓冲液中操作,无需任何表面固定,因此即使对于体积较大、不稳定的样品,比如脂质体、纳米材料或者膜蛋白,也同样适用。MST将荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度结合起来,快速、可信地检测分子间相互作用。MST可用于检测小分子之间、蛋白和蛋白之间、多蛋白复合物之间的相互作用,应用范围广泛。
5、等温滴定量热(ITC)系统
等温滴定量热系统提供MonolithNT.115微泳动量热生物分子相互作用检测服务项目。微量热泳动(MicroScaleThermophoresis,MST),通过精确检测荧光变化,结合灵敏的热泳动现象,MST提供了一种灵活、强大和快速测量分子间相互作用的方法。
等温滴定量热法(ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术,可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力,无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。通过测量结合过程中的热传递,就能够准确地确定结合常数(KD)、反应化学量(n)、焓(∆H)和熵(ΔS)。这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。ITC不仅可测定结合亲和力,还能阐明潜在分子相互作用的机制。
测量原理:等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓,无需使用标记。
工作原理:热核心:微量热计中有两个池,其中一个含有水,作为参比池,另一个含有样品。微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差,并反馈给加热器,由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。
进行测量:参比池和样品池被设定到所需的实验温度。将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。如果有配体与蛋白质结合,则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。进行第一次注射时,微量热计测量被释放的所有热量,直到结合反应达到平衡。测得的热量与结合量成正比。
结果和数据分析:
示例中,反应是放热的,意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。随着两个池的温度恢复到同一水平,信号也回到其起点。将第二小份配体试样注入到样品池中,同样,微量热计补偿所检测到小幅热量变化。配体与蛋白质之间的摩尔比随着一系列配体试样的注入而逐渐增加。蛋白质越来越饱和,配体结合的次数越来越少,并且热量变化开始减小,直到样品池中的配体数量相对于蛋白质而言最终表现出过量为止,从而使反应朝饱和的方向进行。
然后对每个峰的面积进行积分,并以配体与蛋白质的摩尔比作为横坐标进行绘图。由此得出的等温线可拟合至导出亲和力(KD)的结合模型。结合等温线中心的摩尔比即为反应化学计量。下图给出了1:1结合反应的示例图。
焓(ΔH)也可通过等温线直接导出,它表示每摩尔结合配体所释放的热量。这就意味着一次ITC实验就可提供丰富的结合反应信息,有助于理解相互作用的性质并探索热力学驱动因素。
6、圆二色光谱(CD)结构分析系统
利用蛋白质的圆二色性及不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析。圆二色谱在远紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质肽键的排布信息,计算所得的是蛋白质二级结构比例,即α-螺旋、β旋折叠、转角和不规则卷曲的比例;圆二色谱在近紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。
基本流程:
客户提供:
提供样品:
远紫外:浓度>0.5mg/ml,样本量>200μg,纯度>90%;近紫外:浓度>5mg/ml,样本量>2mg,纯度>90%;不要添加任何保护剂或其他物质(透明性极好的磷酸盐可用作缓冲体系)提供信息:样品制备方法及缓冲液信息、纯度检测方法及结果图谱数据;样品如被修饰,请详细告知修饰方法。